原创《藕组织切片制作方法显微结构》：该文是关于切片论文范文，为你的论文写作提供相关论文资料参考。
摘 要：通过组织切片制片和染色方法改进,建立了能够清晰显示藕的组织和细胞结构的技术体系,并在此基础上分析了淀粉粒、维管束和分泌细胞的分布规律.
关键词：藕；组织切片；显微结构
中图分类号：S645.101
文献标识号：A
文章编号：1001-4942（2015）10-0029-04
莲是睡莲科多年生水生草本植物,藕是其膨大的根状茎,藕营养成分丰富,是我国优良的特色蔬菜和副食佳品.藕的地方品种数量繁多,品质各有特色.随着我国人民生活水平的改善,消费者对藕品质的要求日益提高,其品质性状成为莲藕育种和食品领域专家关注的重点.
以往对于藕品质的研究,主要从测定其所含糖类、淀粉、纤维素等成分入手,而针对其细胞形态和内含物质分布规律的研究比较缺乏.石蜡切片技术被广泛应用于植物组织结构研究,但是对于不同特性的植物样品,需要对制片和染色方法进行改进.目前尚未见藕石蜡切片制作技术相关研究的报道.
本实验室前期研究发现,莲藕细胞内含有大量淀粉粒,使用蕃红、固绿和甲苯胺蓝等传统染色方法对藕的石蜡切片进行染色,效果不够理想.为此笔者经过多次试验探索出PAS反应-甲苯胺蓝双重染色的方法,它能清晰显示出藕的细胞壁、维管束和淀粉粒等结构,从而可增进对莲藕组织结构的了解,也为进一步研究其发育过程和贮藏物质积累规律提供必要技术手段.
1材料和方法
1.1试验材料
莲藕杂交品系由山东省农业科学院水生生物研究中心培育,种植于该院饮马泉试验基地.2014年12月设三个取样点挖取其膨大的地下茎,选其节段中部为供试材料.
1.2试验方法
1.2.1所需试剂 ①FAA固定液：50%乙醇： ：冰醋酸等于90：5：5.②席夫（Sehiff）试剂：称取碱性品红0.5g,加入蒸馏水100mL,沸水浴加热溶解5min,冷却至室温后经滤纸过滤,加入偏亚硫酸氢钠1g和浓盐酸2mL,充分混匀后避光密封保存,约24h后试剂变成浅 即可使用.③改良甲苯胺蓝染色液：称取甲苯胺蓝0.5g,加入30%乙醇100mL,加热至65℃,搅拌30min,过滤后避光保存.
1.2.2制片 石蜡切片方法参照田晨霞等的方法并进行改进,具体步骤为：
①固定：将莲藕茎段中部切成厚度2mm的薄片,浸入FAA固定液中,用真空泵抽气20min,固定12h以上.
②脱水：依次通过质量分数为50%、75%、95%、100%梯度乙醇溶液,100%乙醇溶液需更换3次,每次2h.依次通过体积比为50%、75%、100%梯度乙醇/二甲苯溶液,100%二甲苯溶液需更换3次,每次2h.
③浸蜡：将样品浸入50%石蜡/二甲苯溶液中,置于60℃烘箱,6h后将50%石蜡/二甲苯溶液吸出,换全蜡3次,每次6h.将样品倒入包埋模具中,冷却至室温.
④切片：在转轮式切片机上切成厚度为10μm切片,置于载玻片上,40℃展片；载玻片上的水分彻底蒸发后,用二甲苯脱蜡、无水乙醇浸洗.
⑤复水：依次通过质量分数为100%、95%、75%、50%和30%梯度乙醇溶液.
1.2.3染色 以传统的甲苯胺蓝染色法作为对照,使用PAS-甲苯胺蓝染色法对藕石蜡切片进行染色,具体步骤如下：
①PAS染色：参考Bronner的方法,并进行改进.将粘附有切片的载玻片浸入0.4%（W/W）的高碘酸钾溶液中处理20min,自来水冲洗,蒸馏水浸洗3次,每次2min；浸入Sehiff试剂中染色20min,自来水冲洗,蒸馏水浸洗2次,每次1min.
②甲苯胺蓝染色：将载玻片浸入改良甲苯胺蓝染色液中,染色10min,自来水冲洗,蒸馏水浸洗2次,每次1min,35℃烘干.中性树胶封片,镜检拍照.
2结果和分析
2.1染色效果比较
在显微镜下观察传统甲苯胺蓝染色法染色后的藕石蜡切片（图1）,可以看到,甲苯胺蓝对不同成分的着色特异性较差,只能将淀粉粒和薄壁细胞染为淡蓝色（图1A）,并且对表皮细胞着色过深（图1B）,无法看清细胞内含物质情况.
使用PAS-甲苯胺蓝双重染色法获得的切片,细胞形态饱满,细胞壁被染为蓝色,细胞内的淀粉粒被染为紫红色,维管束、气腔和分泌细胞等结构清晰（图2B）.本方法不但能够区分不同组织和结构的分布情况,而且染色效果稳定,经封片后可以保存数月而不褪色.
2.2藕组织结构观察
以最外层的细胞为第1层细胞,依次向内统计细胞层数.藕的表皮共有2层细胞构成,其细胞壁较厚,细胞内不含淀粉粒；其中第1层细胞的内含物较少,第2层细胞被黑褐色物质充满,可能是由酚类物质在制片过程中受到氧化形成的（图2B）.从第3层细胞开始呈现薄壁细胞形态,细胞体积和内部淀粉粒的体积逐层增大（图3、图4）,至第6层细胞之后,细胞呈相间排列,分层不明显.薄壁细胞之间散在分布有维管束,靠近表皮的维管束较细（图2C）；靠近内侧的维管束较粗,有2～3层维管束鞘细胞包围,内部含有气腔（图2D）.
此外,在薄壁细胞之间分布有少量的分泌细胞（图2B、图2D）,分泌细胞内部的物质在切片制作过程中氧化成黑褐色的颗粒,推测这些物质中含有较多的酚类,可能和藕食品加工过程中的褐化现象有关.
3讨论和结论
本研究改进组织切片染色方法后,能清晰显示出藕的组织和细胞结构.传统的石蜡切片染色方法,使用蕃红、固绿和苏木精等染料,若染色条件控制不当会导致染色不足和染色过度.本研究改为双重染色法,首先使用PAS反应将淀粉染成鲜红色,再用甲苯胺蓝将细胞壁染为蓝色（淀粉粒也轻微着色而变成紫红色）,染色效果清晰稳定（图2）.
淀粉的含量和性质和藕的品质密切相关.本试验建立的组织制片技术体系能够清晰地显示淀粉粒的分布,对研究莲藕淀粉的积累规律和评价莲藕种质资源均有重要意义.本试验发现藕表皮细胞和分泌细胞中含有的物质氧化后变为黑褐色,这些物质可能和藕烹饪过程中的褐化现象有关,需要进一步探明褐化物质的成分和积累规律.本研究成果为在细胞生物学水平上研究莲藕品质性状奠定了基础,我们将结合其它技术手段解析影响莲藕品质的构成因素,推动莲藕品质育种进步.
切片论文参考资料：
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