原创《大白菜抗根肿病基因CRb分子标记验证和种质资源筛选》：该文是关于种质资源论文范文，为你的论文写作提供相关论文资料参考。
摘 要：大白菜根肿病是一种严重影响大白菜生长的土传病害,已成为大白菜的重要病害之一.CRb基因是抗大白菜根肿病的重要基因.本研究对已发表的6个CRb分子标记进行筛选,获得1个和CRb紧密连锁的共显性标记TCR05.该标记在抗病纯和材料中产生279 bp的PCR扩增片段,在感病材料中产生250 bp的PCR片段,在抗病杂合材料中同时产生279 bp和250 bp的PCR片段.利用TCR05对24份育种材料进行筛选,均含CRb基因,其中8份为纯合体,16份为杂合体,筛选结果和田间鉴定结果基本一致.
关键词：大白菜；根肿病；CRb；分子标记；种质资源
中图分类号：S634.102.4文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）06-0007-04
大白菜是原产于中国的重要蔬菜作物.大白菜根肿病是由芸薹根肿菌侵染所致的一种土传性病害[1].根肿菌自大白菜根毛侵入细胞内,从根部皮层进入形成层,根部薄壁细胞受刺激而加速分裂,导致根部长出肿瘤,植株萎蔫死亡[2].迄今,至少有8个大白菜抗根肿病基因得到定位,分别是Crr1、Crr2、Crr3、Crr4、CRa、CRb、CRc和 CRk[3～7].其中,CRb对根肿菌生理小种2、4和8均具有良好抗性,并表现为单基因显性遗传特性[6].本研究对已发表的6个CRb标记进行验证,并对24份抗性种质资源进行分析,以期在大白菜抗根肿病育种中对CRb基因的跟踪和提供抗性种质资源提供支持.
1材料和方法
1.1试验材料
供筛选和基因CRb紧密连锁标记的试材为抗根肿病大白菜自交系YH-036、感根肿病自交系冠291以及两者的杂交组合.
供筛选种质资源共24个（表1）,其中BCYM-1～BCYM-4和ZY-1～ZY-4为8个抗根肿病大白菜自交系,其他16个为日本和韩国种子公司正在测试尚未推广的新品种.每个自交系和品种选取最优良的单株进行测试.
1.2试验方法
1.2.1抗根肿病基因CRb分子标记供试引物及其序列供筛选的和基因CRb紧密连锁的6对引物及其序列见表2.
1.2.2DNA提取及PCR扩增利用改良CTAB法提取大白菜基因组DNA[8].用于PCR反应的试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司.
PCR反应总体积为20 μL：在96孔的PCR板中分别加入PCR Master Mix（2×） 10 μL,上游引物和下游引物（10 U）各1 μL,50 ng/μL的模板DNA 2 μL,ddH2O补齐至20 μL.
PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性0.5 min,62℃退火1 min,72℃延伸1 min,35个循环；72℃重延伸10 min,4℃保存.
PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电压5 V/cm条件下电泳1 h,用Goodview染色,Bio-RAD凝胶成像系统成像,观察并保留结果.
1.2.3分子标记筛选分别取YH-036、冠291和其杂交组合各16株用6对候选引物进行PCR扩增和分析,筛选出最佳的分子标记.
1.2.4大白菜种质资源PCR鉴定利用筛选的分子标记对24份大白菜种质资源进行鉴定分析.
1.2.5大白菜种质资源抗病性调查大白菜种子催芽后播种于50孔穴盘,穴盘中所用基质均经过高温灭菌,放置在光照培养箱中培养.每份大白菜种质资源设4个重复,每个重复6株,随机排列.
将高感根肿病病株的病根清洗干净后称重,加入适量的水,用粉碎机磨碎至匀浆和灭菌基质混合,用血球计数板计数使浓度达到2×108个孢子/g基质,并将土壤pH值调整至5.5左右,为病菌发病营造良好条件.
待大白菜苗长至3～4片真叶时移栽至加入菌土的营养钵中,保持基质湿度60%左右,置于25℃光照培养箱中培养40天后,对植株进行抗病性调查.将植株取出后,洗净根部泥土,调查记录抗病性.主根和侧根或须根都无肿瘤记为抗病,只要在主根、侧根或须根出现肿瘤,不分大小均记为感病.
2结果和分析
2.1分子标记筛选
6对候选引物对大白菜抗、感病自交系及其杂交组合的PCR扩增结果表明,只有TCR01和TCR05能扩增出鉴定大白菜抗根肿病基因CRb呈阳性或隐性的共显性特异性条带.其中TCR05在抗病自交系YH-036中扩增出一条279 bp的PCR片段,在感病自交系冠291中扩增出一条250 bp的PCR片段,在其杂交组合中扩增出和其亲本对应的两条条带（图1）,和文献[6]报道一致,且在多次重复试验中表现稳定.因此,TCR05可以作为鉴定大白菜抗根肿病基因CRb呈阳性或隐性的理想分子标记.
2.2大白菜种质资源PCR鉴定
利用分子标记TCR05对24份大白菜种质资源CRb基因进行鉴定分析（表3）.如图2所示,TCR05在24份大白菜资源中均能扩增出PCR片段,其中1～8号种质资源均只扩增出一条279 bp的抗病片段,鉴定为CRb/CRb纯合的种质资源；其他16份材料中均分别扩增出279 bp的抗病片段和250 bp的感病片段,鉴定为CRb/crb杂合的种质资源.
2.3大白菜种质资源抗病性鉴定结果
供试的24份大白菜种质资源总体表现为抗根肿病,但11、18、24号种质资源中个别单株出现了肿瘤.其中,11号供试材料的侧根共出现3个直径5 mm左右的肿瘤,地上部病症表现不明显；18号供试大白菜资源的主根共出现5个3 mm左右的肿瘤,地上部表现出失水萎蔫现象；24号仅在须根部位出现细微突起,地上部植株生长无明显影响（表4）.
3讨论和结论
根肿病最早于1737年在英国地中海西岸和欧洲南部发现,现已成为一种世界性病害[9].近年来,我国大白菜根肿病发病范围迅猛扩大,面积急剧增加,造成大白菜产量和品质大幅度降低,已成为大白菜主要病害之一.生产实践证明,栽培措施和化学、生物等防治方法不仅效果甚微而且化学防治污染环境[10],选育抗根肿病大白菜新品种是一条有效、经济和环保的途径[11].源于欧洲芜菁的多个抗病基因已成功导入到大白菜种质中,但目前大白菜根肿病的抗性检测主要采用人工接种鉴定方法,接种效果受外界环境的影响大、效率低,不能鉴定抗性基因的类型[12].因此,育种中急需运用分子标记辅助育种方法弥补人工接种的缺陷.本研究筛选出一个和抗病基因CRb紧密连锁的SCAR标记TCR05,具有结果稳定可靠、操作简便、效率高、可鉴别杂合子和纯合子等优点,可有效用于今后抗根肿病大白菜育种工作中.
种质资源论文参考资料：
结论：大白菜抗根肿病基因CRb分子标记验证和种质资源筛选为大学硕士与本科种质资源毕业论文开题报告范文和相关优秀学术职称论文参考文献资料下载，关于免费教你怎么写种质资源库包括方面论文范文。
