原创《14例白骨化尸体牙齿DNA检验分析》：此文是一篇骨化论文范文,为你的毕业论文写作提供有价值的参考。
摘 要：本文主要通过对实践工作中遇到的14例白骨化尸体牙齿的DNA检验分析,阐述了该类案件中提取牙齿作DNA检验的优势,以及总结了运用简易砸牙器和硅胶模柱手工纯化技术作牙齿DNA检验的实用方法.
关键词：白骨化；牙齿；砸牙器；DNA检验
中图分类号：D919 文献标识码：A 文章编号：2095-4379-（2015）26-0175-02
作者简介：张晓宇（1981-）,男,汉族,内蒙古包头人,大学本科,广州市*局花都区分局刑事*大队,主检法医师,研究方向：法医病理学.
在白骨化尸体案件中,尸体大多暴露在野外,环境较为恶劣,存放时间长,通常能进行个体识别和亲子鉴定的生物检材只有骨骼和牙齿.由于此类检材运用的提取、纯化方法较为复杂,成功检出STR分型存在一定的难度,因此被归类为疑难生物检材；另外,在检验过程中往往要借助如液氮研磨仪等价格昂贵的辅助设备,因此在一般DNA实验室都不开展这项工作.本文介绍在工作实践中提取的14宗白骨化尸体案件中的牙齿,运用简易的砸牙器进行预处理,采用QIAampR DNA Invesstigator Kit试剂盒手工法进行提取、纯化,均成功地检出STR基因分型,此方法实用,供同行借鉴参考.
一、材料和方法
(一)样本
在工作实践中遇到的白骨化尸体案件14宗,均在现场提取到牙齿.其中：死亡时间在两年以上的1宗,一年以上的6宗,半年左右的7宗；尸骨存放在室内的1宗,暴露在山上树林或草丛的9宗,水中的3宗,土埋的1宗.
(二)样本预处理
在各宗案件现场提取到的牙齿中,磨牙选取1颗,尖牙或切牙选取2颗；将选取的牙齿放置在干净的小烧杯中,倒入蒸馏水浸泡,使牙齿表层的污垢变疏松,然后用手术刀刮净牙齿表面的污垢物,用蒸馏水反复冲洗多次至牙齿表面干净；将洗好的牙齿放入干净的小烧杯中,倒入适量的5%的次氯酸钠溶液浸泡15分钟后弃去液体,用蒸馏水冲洗5次,然后加入去离子水浸泡5分钟,以去除次氯酸钠,再用无水乙醇泡洗2次,取出牙齿用滤纸擦干待用.
(三)DNA提取
将上述处理过的牙齿放置在简易的砸牙器中,用铁锤将牙齿砸成粉末状,将粉末分成两份分别加入到1.5ml的离心管中；然后往离心管中加入适量的EDTA脱钙液,常温下震荡脱钙12小时以上,期间震荡3-5次,每次震荡后确保离心管的盖子盖紧；脱钙完毕后,13000rpm离心5分钟,弃去上清液,向含有牙齿粉末的离心管中加入300-500ul骨骼裂解液（Promega公司）、20ulDTT溶液（1mol/L）、20ulPK溶液（20mg/ml）,于56℃消化12小时以上,期间震荡几次,每次震荡后确保离心管的盖子盖紧；再按前量补加DTT及PK溶液,消化6小时以上,期间震荡多次；裂解完毕后,震荡,13000rpm离心5分钟,分别将两个离心管中的上清液转移至同一个干净的1.5ml的离心管中进行纯化.
运用QIAampR DNA Invesstigator Kit试剂盒,参照该试剂盒操作手册中《从骨头和牙齿中分离总DNA》的方法步骤,利用手工法纯化上述预处理后的上清液.选取DNA洗脱液的体积为30ul.
(四)STR分型检测
上述DNA提取产物均用9700型PCR扩增仪（AB公司,美国）按PowerPlex_21试剂盒（Promega公司,美国）操作手册的程序进行PCR复合扩增,反应体系为10ul体系,模板DNA量为4ul.扩增产物采用3130XL型基因分析仪（AB公司,美国）进行分型检测.用GeneMapper v3.21进行DN*段分析,观察该样本的STR分型结果.
二、结果
经GeneMapper v3.21进行DN*段分析,其中有11宗案件的牙齿均一次就检出21个基因座的完整STR图谱,另3宗死亡时间较长的案件检出的STR图谱出现较大位点等位基因峰低和1-3个基因座位点缺失的情况,通过改变扩增体系和增加DNA模板量均检出21个基因座的完整STR图谱,如图1所示.
三、讨论
牙齿是有高度钙化组织构成的器官,是人体最坚硬的组织和保存时间最长的器官,由于牙齿的特殊结构,用作DNA检验的牙本质和牙髓组织外层都有牙釉质或牙骨质包裹,不易受环境和理化因素的影响,这种稳定性使牙齿成为DNA检验很好的生物检材.本文所做的14宗案件的牙齿很好的证明了这点,不管是暴露在野外、土埋还是浸泡在水中的牙齿,均成检出完整的STR分型,死亡时间在两年以上的也是如此.但实验图谱也显示,随着死亡时间的延长,也出现的DNA降解的情况,具体的影响因素及降解速度则需要更多的实验来研究.
在白骨化尸体的案件现场,大多提取牙齿或四肢长骨进行DNA检验,而相对于长骨,牙齿的提取保存更为方便,并且在检验过程中,四肢长骨一般得运用价格昂贵的液氮研磨器进行研磨,而牙齿则可以运用简易的砸牙器砸成粉末状进行脱钙处理,对于区、县一级或经济状况较差的DNA实验室,牙齿的DNA检验更符合实际工作.在实验中,最好选取磨牙进行检验,因为相关报道称磨牙的DNA获得量比尖牙或切牙高很多倍,更容易检出完整STR分型,并且由于磨牙不容易从牙槽骨中脱落,在案件现场更容易提取到.
此外,在牙齿DNA检验过程中,我们应该注意以下几点问题：1、白骨化尸体现场提取到的牙齿大多暴露在恶劣的环境中,表层都附着一层污垢,在预处理过程中一定要将污垢刮干净,以免造成扩增的抑制；2、在牙齿粉末的脱钙及裂解过程中,震荡后一定要确保裂解管盖子盖紧,以免造成液体的挥发；3、对存放时间较长的牙齿,可运用较大扩增体系,选择不同的浓度梯度进行扩增,选取较好的结果；4、用GeneMapper v3.21进行DN*段分析时,特别要注意存放时间较长的牙齿样本,较大位点基因座容易出现峰低现象,在峰值较低且检出纯合子的基因座需注意是否出现漏扩增,出现这样情况可以运用Minifiler试剂盒扩增进行补充.
[ 参 考 文 献 ]
[1]张志愿主编.口腔科学[M].北京：人民卫生出版社,2004.
[2]侯一平主编.法医物证学[M].北京：人民卫生出版社,2004.
[3]吴梅筠主编.法庭生物学[M].成都：四川大学出版社,2006.
[4]凃政,刘志芳,陈松等.牙齿的DNA提取及STR分型研究[J].刑事技术,2007（05）.
骨化论文参考资料：
结论：14例白骨化尸体牙齿DNA检验分析为关于骨化方面的论文题目、论文提纲、骨化三醇论文开题报告、文献综述、参考文献的相关大学硕士和本科毕业论文。
