原创《甜樱桃砧木吉塞拉离体茎尖玻璃化法超低温保存》：该文是关于吉塞拉论文范文，为你的论文写作提供相关论文资料参考。
摘 要：为保持甜樱桃矮化砧木吉塞拉的遗传稳定性和避免种质遗传资源丢失,以玻璃化法超低温冷冻保存过程中涉及的主要因子设计正交试验,摸索适合吉塞拉的最佳保存体系；设计单因子试验,观察不同单因子对吉塞拉超低温冷冻保存的影响.结果表明,取生长90 d的组培苗于4 ℃低温锻炼3周或4周,剥取茎尖放于含0.3 mol/L蔗糖的预培养液中预培养1 d,在装载液中渗透30 min,用PVS3玻璃化试剂0 ℃处理60 min后投入到液氮中保存24 h,取出后经40 ℃水浴快速化冻1 min,卸载液洗涤两次,每次10 min,后置于恢复培养基上,茎尖的存活率最高且遗传稳定性好.本试验成功建立了甜樱桃矮化砧木吉塞拉的玻璃化法超低温保存技术,为甜樱桃种质资源的长期保存提供了一条有效途径.
关键词：甜樱桃；矮化砧木；吉塞拉；茎尖；超低温冷冻保存；玻璃化法
中图分类号：S662.509+.3文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）10-0134-07
我国具有丰富的樱桃种质资源,包括本土的中国樱桃和引进的甜樱桃品种及砧木资源,这些是进行抗性育种的基因库及进行种质改良的基础[1].然而建立一个樱桃种质资源圃需要投入大量的人力、物力和土地[2].因此,投入少、占地少且长期稳定的种质资源超低温冷冻保存方法逐渐被公认[3-5],尤其是对果树等木本植物的保存.大多数果树由于其遗传和繁殖特点不能用种子进行保存,而以活体资源圃的方式保存又存在诸多问题,如成本高、效率低,且种质资源在保存过程中易发生变异等[6,7].迄今已有10多种果树茎尖的超低温保存获得了成功,如苹果、杏、柑橘、桃、柿子等[8-12].和苹果、杏等果树的超低温保存研究相比,樱桃超低温保存的研究较少,赵艳华等[13]用玻璃化法成功保存了马哈利樱桃的离体茎尖；Niino等[14]用玻璃化一步法成功保存了日本山樱、大岛樱及大紫甜樱桃等的离体茎尖.吉塞拉（Gisela）砧木是德国吉森大学以酸樱桃（Prunus cerasus L.）和灰毛叶樱桃（P. canescens L.）为亲本种间杂交得到的三倍体矮化砧木[15].吉塞拉树体开张,分枝基角大,在欧洲、北美应用广泛[16,17].吉塞拉引进我国后和大多数甜樱桃品种亲合性良好,具有明显的矮化、丰产、早实性强、抗病、抗寒、土壤适应范围广等优良特性[18-20].吉塞拉的引进及推广利用有利于克服我国甜樱桃生产的树体高大、难于管理等问题.然而随着现代甜樱桃生产的发展,矮化砧木品种在大范围内推广,原始品种和地方育种优系被陆续淘汰,这一方面改良了砧木,另一方面也造成了甜樱桃砧木种质资源的贫乏.
因此笔者尝试以甜樱桃矮化砧木吉塞拉为材料来研究樱桃的超低温冷冻保存技术,通过改进玻璃化法超低温保存条件,在保证吉塞拉种质资源遗传稳定性的基础上,进一步优化试验条件,提高冷冻保存的效率及稳定性.
1材料和方法
1.1试验材料
以甜樱桃矮化砧木吉塞拉5和吉塞拉6的离体茎尖为材料,组培苗在继代培养基MS+0.5 mg/L BA+0.05 mg/L NAA+0.5 mol/L 蔗糖+0.7%琼脂（pH 5.8）上生长90 d,培养温度（25±2） ℃,光照强度75 μmo1/（m2·s）,光周期16 h/d.
1.2试剂
预培养液（蔗糖梯度）：MS+0～1.2 mol/L蔗糖；装载液：MS+2 mol/L甘油+0.4 mol/L蔗糖；PVS2：MS+30%（W/V）甘油+15%（W/V）乙二醇+15%（W/V）二 亚砜+0.4 mol/L蔗糖；PVS3：50% （W/V）甘油+50% （W/V）蔗糖；卸载液：MS+1.2 mol/L蔗糖.恢复培养基：MS+0.5 mg/L BA+0.5 mol/L 蔗糖+0.7%琼脂（pH等于5.8）.Tiangen PCR mix；天根公司的快捷型植物基因组提取试剂盒（非离心柱型）；SSR引物由上海生工合成；PAGE凝胶所用药品均购买于上海生工.
1.3正交设计
根据L9（34）设计正交试验,以吉塞拉5为材料,选择低温锻炼时间、预培养液蔗糖浓度、预培养时间三因素,每因素设计三水平,共9组试验,每组重复3次,取平均值.利用SPSS 11.5软件和Microsoft Excel进行数据分析和作图.
1.4吉塞拉茎尖玻璃化法超低温保存步骤
取继代生长90 d的组培苗于4 ℃光照培养箱中低温锻炼0～10周.取带顶芽的茎段,在显微镜下剥取长度约1.5 mm的茎尖（不大于2 mm,一般含1～2个叶原基）,放入预培养液中1～5 d,每组茎尖不低于30个；茎尖经过预培养后,放入装载液中,室温静置30 min；去除装载液,加入玻璃化溶液PVS2或PVS3,在0 ℃条件下放置30～90 min；吸掉玻璃化溶液,重新加入适量玻璃化溶液至恰好浸没茎尖,将冻存管放入液氮中冷冻5 min,再转移到大液氮罐中保存.从液氮罐中将冷冻24 h的冻存管取出,迅速放入40 ℃温水中快速化冻1 min,加入卸载液,洗涤两次,每次10 min,将茎尖转移到恢复培养基中,暗培养1周后转到光照培养室内培养,培养温度（25±2） ℃,光周期12 h/d,光照强度75 μmo1/（m2·s）.
光培养恢复2周后统计存活率,茎尖保持绿色或黄绿色、长出小叶或者脱分化形成愈伤组织的茎尖均视为存活.存活率（%）等于存活的茎尖个数/总茎尖数×100,取3次重复的平均值.
1.5吉塞拉茎尖超低温保存后再生苗生长情况调查
选取长势一致、生长健壮的冷冻前后的吉塞拉5和吉塞拉6扩繁材料,接入继代培养基,每品种接6瓶,每瓶接4个芽,同品种放置在同一架面培养,培养温度（25±2） ℃,光照强度75 μmo1/（m2·s）,光周期16 h/d.40 d后,取出材料调查再生苗生长情况.
吉塞拉论文参考资料：
结论：甜樱桃砧木吉塞拉离体茎尖玻璃化法超低温保存为关于本文可作为相关专业吉塞拉论文写作研究的大学硕士与本科毕业论文吉塞拉6好还是12好论文开题报告范文和职称论文参考文献资料。
